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  • CCK-8 细胞增殖.毒性检测试剂盒
  • CCK-8 细胞增殖.毒性检测试剂盒
    Cell Counting Kit简称CCK-8试剂盒,为MTT法的替代方法,是一种基于WST(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。CCK-8 细胞增殖.毒性检测试剂盒

    Cell Counting KitCCK-8试剂盒)


    目录号

    产品名称

    规格

    包装

    CC-K01

    Cell Counting Kit

    100

    1mL

    CC-K05

    Cell Counting Kit

    500

    5x1ml

    CC-K10

    Cell Counting Kit

    1000

    10x1mL

    CC-K30

    Cell Counting Kit

    3000

    30xmL


    产品简介:

    Cell Counting Kit简称CCK 试剂盒,为MTT法的替代方法,是一种基于WST(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。


    CCK-8法与其它检测方法之间的比较:

    细胞计数方法

    MTT

    XTT

    WST-1

    CCK-8

    形成的formazan的水溶性

    产品性状

    粉末

    2瓶溶液

    溶液

    1瓶溶液

    使用方法

    配成溶液后使用

    现配现用

    无需预制

    无需预制

    检测灵敏度

    很高

    很高

    检测时间

    较长

    较短

    较短

    zui短

    检测波长

    560-600nm

    420-480nm

    420-480nm

    430-490nm

    细胞毒性

    高,细胞形态完全消失

    很低,细胞形态不变

    很低,细胞形态不变

    很低,细胞形态不变

    试剂稳定性

    一般

    较差

    一般

    很好

    大批量样品检测

    可以

    非常适合

    非常适合

    非常适合

    便捷程度

    一般

    便捷

    便捷

    非常便捷









    CCK用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

     操作说明:

    一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

    1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。

    2、按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。

    3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。)

    二、细胞活性检测

    1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37,5% CO2的条件下)。

    2、向每孔加入10 μLCCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

    3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

    4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

    5、如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

    三、细胞增值-毒性检测

    1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在375% CO2的条件下)。

    2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

    3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6122448小时)。

    4、想每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

    5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

    6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

    7、如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

    注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
     备注:
    建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。
    有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔减的差异。加入CCK试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。
    白细胞可能需要培养较长时间。
    当使用标准96孔板时,贴壁细胞的zui小接种量至少为1,000 / (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 / (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。
    如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度zui高。

    培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

    活力计算:

    细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A0加药)-A(空白)] ×100
    A(加药):具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
    A(空白):具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
    A0加药):具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
    *细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

    1.一个孔中应接种多少个细胞当使用标准96孔板时,贴壁细胞的zui小接种量至少为1,000 / (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 / (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

    2.能否用384孔板进行试验?

    可以。向各孔中加入培养基体积10%CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量。

    3.能否用24孔板进行试验?

    可以。向各孔中加入培养基体积10%CCK-8溶液。

    4.酚红会影响检测吗?

    不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

    5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性?

    有。然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。

    6.CCK-8能否检测细菌细胞?

    可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液,隔夜或培养1-4个小时7.CCK-8稳定吗?

    CCK-80-5下能够保存至少6个月,在-20下避光可以保存1年。如果需要长期保存,我们推荐-20的储藏条件。

    8.如果没有450 nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片?

    还可使用450 nm490 nm之间的滤光片。

    9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差?

    可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

    10.CCK-8是什么颜色?

    应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。

    11.CCK8能否对活细胞进行染色?

    不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8),并通过电子载体1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能对细胞进行染色。

    12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒?

    CCK8溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如隔夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。

    13.在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?

    有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK8,测定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (CCK8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK8之前更换培养基,去掉药物的影响。

    14.每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?

    可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板zui外一圈的孔zui容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,zui外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000/孔范围内摸索条件。

    15.如何设定空白对照?

    在不含细胞的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。

    16.哪些物质会影响CCK8的测定?

    当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,例如含有维生素CGlucose (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。

    17.在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?

    可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如:可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

    18.设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?

    不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

    19.说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板货12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?

    一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10

    20.CCK-8显色过程中,如何终止反应?

    有一下几种方法(96孔板): 1 在显色反应后,将培养板仿佛4冰箱内。 2 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3 每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。

    21.必须预培养细胞吗?

    不一定。如果要向保持细胞的zui好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

    22.如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?

    金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%15%90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。

    23.CCK-8试剂的保存条件?

    在避光条件下CCK-8试剂在4可保存一年。如果需要保存较长时间的话,推荐在-20下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4冰箱内保存。

    24.预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?

    一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

    25.CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

    不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

    26.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?

    悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。

    27.应该每次做标准曲线吗?

    建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。

    28.有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?

    不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。

    29.实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应?

    建议使用一个孔作一下检测,因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。

    保存条件:

    4干燥避光保存,有效期一年。

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